Основы строения волоса, микроскопирование объекта

Прежде чем приступить к выделению ДНК из исследуемого волоса, необходимо провести его микроскопирование и установить наличие или отсутствие луковицы волоса, а также по виду луковицы определить, живой или отмерший волос представлен на исследование. Кроме этого, в некоторых случаях микроскопирование позволяет установить наличие определенных загрязнений на волосе. Особенно принципиальным является наличие на волосе клеток крови или спермы (других выделений), что может исказить результат определения генотипа ДНК волоса. Загрязненные волосы особенно тщательно моют (см. ниже).

Известно, что волосы, являясь производными кожи, состоят из корня, расположенного в дерме, и стержня, выходящего на поверхность кожи через волосяную воронку. Корень волоса окружен эпителиальными оболочками - это фолликулы волоса. Расширенная часть фолликула называется луковицей волоса. Луковицы вырванного и выпавшего волос различаются по внешнему виду (рис. 1). Больше всего ядерных клеток содержится в луковице волоса, из которой можно выделить достаточное количество ядерной ДНК. Стержень волоса состоит из кутикулы (ороговевшие клетки), коркового слоя (кератиновые структуры) и сердцевины (фибриллярная система).

При исследовании ДНК волос, как показал анализ опубликованных данных, большое значение имеет наличие и количество пигмента волос - меланина. Показано, что меланин ингибирует реакцию амплификации и ее положительный результат зависит от соотношения в образце количества выделенной ДНК и количества меланина.

Меланин содержится в основном в сердцевине волоса и может быть в виде гранул или в диффузном состоянии. Меланины являются полимерами хиноидных соединений и образуются при ферментативном окислении тирозина. Волосы черного цвета содержат эумеланин, имеющий в структуре азот, для волос желтого и красного цвета характерен феомеланин. Меланин в эпителиальных клетках коркового слоя волос образует с белком волос - кератином мелано-кератиновые комплексы, которые имеют повышенную химическую устойчивость по сравнению с кератинами непигментированных волос. Эффект ингибирования реакции амплификации меланином имеет место, как правило, при исследовании ДНК стержня волоса и зависит от его цвета. Однако в описанной ниже методике действие меланина не учитывается, так как экстрагированная ДНК дополнительно очищается, в том числе и от основного количества меланина, с помощью специального устройства для концентрирования и очистки ДНК "Центрикон-100" (далее по тексту "Центрикон-100").

Микроскопирование волоса проводят без применения каких-либо химических реагентов, а именно без фиксации лаком, использования просветляющих жидкостей и т. п. Волос помещают на предметное стекло, добавляют 1 - 2 капли воды, накрывают покровным стеклом и микроскопируют при увеличении 200´, 400´. Устанавливают наличие или отсутствие целой луковицы. При отсутствии целой луковицы определяют наличие отдельных эпителиальных клеток фолликула волоса, а при отсутствии эпителиальных клеток необходимо установить наличие прикорневой части стержня волоса. В стержне волоса основное содержание ядерных клеток локализовано в прикорневой части. На периферическом конце волоса ядерных клеток нет. Выделение ДНК из перифирического конца волоса рекомендуется использовать как отрицательный контроль для проверки отсутствия загрязнения биологическими примесями.

Кроме того, микроскопированием определяют наличие биологических загрязнений волоса (кровь, сперма, другие выделения), цвет волоса или его искусственную окраску.