Методика выделения ДНК из луковицы волоса

Данная методика используется при исследовании волоса, на корневой части которого присутствуют влагалищные оболочки; это, как правило, бывает у вырванных жизнеспособных волос (см. рис. 1). Используют 20% взвесь ионообменной смолы Chelex, приготовленную в стерильной дистиллированной воде. Принцип метода заключается в гидролизе, "растворении" волоса при кипячении с ионообменной смолой Chelex, которая сорбирует различные примеси, и в том числе примеси белков.

Волос микроскопируют, отмывают (как описано выше), отрезают луковицу волоса с 2 - 3 мм стержня и помещают в пробирку "Эппендорф". В пробирку добавляют 100 мкл 20% взвеси ионообразной смолы Chelex. Выдерживают в термостате при температуре 56 °С в течение 12 ч (ночь). Встряхивают 5 - 10 с на вортексе при высокой скорости. Затем помещают пробирку с волосом в кипящую воду на 8 мин. Волос должен быть полностью погружен в раствор. Опять помещают на вортекс для встряхивания в течение 5 -10 с при высокой скорости.

Гидролизат волоса центрифугируют 2 - 3 мин при 10 000 - 15 000 об/мин. Супернатант используют для постановки реакции ПЦР. В реакцию берут не более 15 мкл образца при суммарном объеме реакционной смеси ПЦР 25 мкл.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

При разработке методики выделения ДНК из волоса с использованием ионообменной смолы Chelex исследовали многочисленные образцы волос, различающихся по длине, цвету, срокам хранения, наличию большего или меньшего количества эпителиальных клеток луковицы, загрязнению волос биологическими примесями (кровь, сперма и др.). Преимуществом данной методики является простота ее использования. Волос выдерживают во взвеси ионообменной смолы Chelex в термостате в течение 12 ч (ночь) и затем в течение ~15 мин (8 мин кипятят) получают гидролизат волоса, содержащий очищенный раствор ДНК, готовый к амплификации. На получение положительного результата (выделенная ДНК амплифицирована) не влияют такие факторы, как длина, цвет, сроки хранения волос. Недостатком методики является необходимое наличие луковицы волоса, что сужает круг исследования волос, поступающих на экспертизу. Волосы, имеющие загрязнение биологическим материалом, требуют специальной обработки раствором глицина и параллельного контрольного исследования периферического конца стержня волоса.

Методика выделения ДНК путем хлороформ-фенольной экстракции и последующих концентрирования и фильтрации экстракта на "Центриконе-100" является более совершенной и более трудоемкой. С использованием этой методики возможно исследовать различные образцы волос, в том числе и стержень единичного волоса. Однако работа с такими низкими количествами ДНК, какие выделяют из стержня единичного волоса, требует, во-первых, высокой степени специализации эксперта и, во-вторых, особых мер предосторожности (с соблюдением чистоты и стерильности) во избежание получения ошибочных результатов. В перспективе, по мере того как концентрирование ДНК на "Центриконе-100" будет внедряться в практику, очевидно, методика получит дальнейшее развитие и совершенство.