Автоматический секвенатор

3. Выходя из спектрофотометра, луч попадает в камеру для измерения его интенсивности, где используется явление фотоэлектронной эмиссии. Соответствующий электрический сигнал также поступает в компьютер.

4. В компьютере регистрируются и все перемещения лазера поперек пластины геля, что позволяет разнести вышеназванную информацию по его трекам.

5. Для каждого трека отдельно, по мере прохождения в нем полос любого цвета флюоресценции, компьютер ведет их счет, определяя тем самым последовательность нуклеотидов во всех секвенируемых одновременно фрагментах ДНК.

6. Все картины прохождения флюоресцирующих полос мимо окна пластины в каждом треке в реальном времени проецируются на дисплей прибора.

7. По окончании процесса электрофореза полученные данные обрабатываются компьютером и печатаются в виде четырехцветных графиков для каждого трека, где видна вся картина следования пиков, их нумерация и однобуквенные обозначения соответствующих нуклеотидов. Благодаря измерению интенсивности каждого цвета флюоресценции вершины пиков хорошо различимы.

Здесь необходимо сделать небольшое отступление. Хотя и было сказано, что рассматривать различные модели секвенаторов не имеет смысла, об одной из них, принадлежащей к последнему поколению, стоит вкратце написать и вот почему. Принципиальное его устройство такое же, но в интересах дальнейшего повышения продуктивности применена новинка, общие перспективы которой следует обсудить. Электрофорез в этом приборе ведут не на пластине геля, а в капиллярах! Вот, как это делается.

В прибор (Beckman СЕФ-2000) устанавливают плашку на 96 лунок (12 рядов по 8 лунок), куда заранее вносят продукты реакций, проведенных по тому же методу Сэнджера с четырьмя люминесцентно мечеными дидезоксирибонуклеотидами. Тандемом к ней ставят вторую точно такую же плашку, лунки которой заполнены буфером. Сам ПААГ готовят так, что он не может запо-лимеризоваться до твердого состояния, а представляет собой вязкую жидкость. Прибор заряжают картриджем, заполненным таким гелем. Восемь тонких и гибких пластмассовых капилляров, длиной около метра, с одного конца закреплены в пластине так, что расстояние между ними равно расстоянию между лунками одного ряда плашки. Концы капилляров выступают из пластины и одеты металлическими трубочками, электрически соединенными с катодом источника высокого напряжения. Благодаря этому в каждую лунку, куда опускаются кончики капилляров, подается отрицательное напряжение электрофореза. Вторые концы капилляров собраны в некий зажим, где они располагаются в одной плоскости вплотную друг к другу. Выходя из дальнего конца этого зажима все восемь капилляров открываются в одну емкость с буфером, куда подается положительное напряжение электрофореза. Но перед этим в окне зажима, против которого приходятся прозрачные участки капилляров, все они сканируются лучом лазера и «отвечают» на это флюоресценцией проходящего мимо фрагмента ДНК. Далее все происходит так же, как описано для секвенатора с пластиной геля.

Но вернемся к началу операции. Первоначально пустые капилляры при помощи насоса целиком заполняются гелем из картриджа. Затем концы их автоматически переносятся и опускаются в восемь лунок первого ряда плашки препаратов. Включается умеренное напряжение и все отрицательно заряженные фрагменты ДНК в течение нескольких секунд входят в гель — из каждой лунки в «свой» капилляр. После этого концы капилляров автоматически переносят в лунки первого ряда плашки с буфером. Напряжение повышается до рабочей величины электрофореза, который продолжается 2 часа. По его окончании гель, с помощью того же насоса выталкивается из капилляров, а сами они промываются водой. Затем капилляры заполняются новыми порциями геля и все операции повторяются для второго ряда лунок с препаратом. И так до последнего, 12-го ряда. За 24 часа прибор может провести электрофорез 96-ти препаратов. Если в одном капилляре удается расшифровать последовательность в 500 нуклеотидов, то всего за одни сутки прибор может определить последовательность для 49 тысяч нуклеотидов. Кроме того оператор освобождается от трудоемкого приготовления пластин с гелем и деликатной операции внесения исходных препаратов в его «карманы».