Автоматический секвенатор
Технический прогресс впечатляет. Но поясню, ради чего было сделано это отступление. Каковы перспективы электрофореза в капиллярах? Не вытеснит ли он классический метод электрофореза в пластинах? Думаю, что не вытеснит и вот почему. В капиллярном методе у экспериментатора нет возможности получить в свое распоряжение сам чистый гель без оболочки, а значит и решить целый ряд задач, описанных в гл. 6. К примеру, как использовать электрофорез в капиллярах для сравнения картин распределения по размерам белков или НК разного происхождения? Пометить их всех люминесцентной меткой и протягивать сплошь прозрачные капилляры мимо лазера, фиксируя времена прохождения каждого из белков или НК? Сложно! А если возникнет необходимость подробнее познакомиться с одним из белков? Найти его снова по времени регистрации и вырезать кусочек капилляра? Или, не меняя описанной конструкции фиксировать времена выхода всех белков из капилляров и сохранять их для последующего анализа? Тогда для каждого капилляра надо поставить свой коллектор фракций, как при хроматографии! А если белки или НК помечены радиоактивной меткой? Укладывать капилляры с гелем на рентгеновскую пленку? Для регистрации в таких условиях потребуется очень большая радиоактивность. Еще хуже с использованием иммунохимических методов для отыскания нужного антигена после электрофореза смеси белков. К белкам в капилляре не подобраться. Значит тестировать антисывороткой поодиночке каждый белок в варианте с коллекторами фракции? И так далее.
Все это очень трудно. Быть может технически разрешимо за счет усложнения и удорожания специальной аппаратуры. Но зачем? Ведь, кроме секвенирования ДНК, при проведении любой другой исследовательской работы электрофорез используется не более, чем несколько раз . Но вернемся к прерванному рассмотрению вопроса об использовании автоматических секвенаторов.
Уже упоминалось, что в одном треке пластины или в капилляре автоматического секвенатора удается надежно определить последовательность нуклеотидов во фрагменте ДНК длиной в 500-600 пар нуклеотидов. Каким же образом расшифровывают весь геном, хотя бы бактерии, где счет идет на миллионы пар? Очевидно здесь пока нет иного пути, чем разбиение всей ДНК генома на куски: сначала более крупные, потом мельче — вплоть до набора фрагментов, доступных для автоматического секвенирования. Средством разбиения могут служить различные рестриктазы или облучение ультразвуком. Сортировку кусков и фрагментов ДНК по размерам можно вести последовательно электрофорезом в мягких гелях агарозы с последующим извлечением их из этих гелей. Отбираются только достаточно крупные фрагменты.
Для обеспечения строгой одинаковости этих крупных кусков ДНК их приходится проводить через операцию умножения клонированием в E.coli. Обычные плазмиды могут вносить в бактерию фрагменты, не длиннее нескольких тысяч пар нуклеотидов. Ограничением служит процесс проникновения перегруженных плазмид в бактериальную клетку. Чтобы обойти эту трудность иногда в качестве переносчиков («векторов») используют так называемые «космиды». Они представляют собой такие гипермо-дифицированные плазмиды, включенные в головку бактериофага «^». (Используется явление самосборки фага.) Бактериофаг впрыскивает всю содержащуюся в нем ДНК через отверстие, которое он «прокалывает» в оболочке бактерии. Эта ДНК в бактериальной клетке циркулизируется и размножается как плазмида. Таким образом удается размножить в E.coli куски чужеродной ДНК длиной в 35-45 тысяч пар нуклеотидов.